Real vaxtda flüoresan kəmiyyət PCR, florofordan istifadə edərək DNT gücləndirmə reaksiyasında hər bir polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) dövründən sonra məhsulun ümumi miqdarını ölçmək üçün bir üsuldur.Metod daxili və ya xarici istinad üsulları ilə sınaqdan keçirilməli olan nümunədə xüsusi DNT ardıcıllığının kəmiyyətini müəyyən etmək üçün istifadə olunur.Yarandığı gündən etibarən floresan kəmiyyət PCR analizləri laboratoriya müəllimləri arasında getdikcə populyarlaşdı.
Flüoresan PCR prinsipi: Əvvəlcə TaqManPCR və daha sonra Real-TimePCR adlanan flüoressensiya PCR 1995-ci ildə ABŞ-da PE (PerkinElmer) tərəfindən işlənib hazırlanmış yeni nuklein turşusunun miqdarının təyini üsuludur. Texnika flüoresan etiketli zond və ya müvafiq probun əlavə edilməsinə əsaslanır. kəmiyyət funksiyasına nail olmaq üçün adi PCR-ə flüoresan boya.Prinsip: PCR reaksiyası davam etdikcə, PCR reaksiya məhsulları toplanır və flüoresan siqnalın intensivliyi bərabər nisbətdə artır.Hər dövrə ilə flüoresan intensivliyi siqnalı toplanır ki, biz flüoresans intensivliyindəki dəyişikliklə məhsulun miqdarının dəyişməsini izləyə bilək və beləliklə, flüoresans gücləndirmə əyri qrafikini əldə edək.
Ümumiyyətlə, flüoresan gücləndirmə əyrisini üç mərhələyə bölmək olar: flüoresan fon siqnal mərhələsi, flüoresan siqnalın eksponensial gücləndirmə mərhələsi və yayla mərhələsi.Arxa fon siqnalı mərhələsində gücləndirilmiş flüoresan siqnalı flüoresan fon siqnalı ilə maskalanır və məhsulun miqdarında dəyişikliklər müəyyən edilə bilməz.Yayla mərhələsində, gücləndirmə məhsulu artıq eksponent olaraq artmır, son məhsulun miqdarı ilə başlanğıc şablon miqdarı arasında xətti əlaqə yoxdur və başlanğıc DNT nüsxə nömrəsi son PCR məhsulunun miqdarına əsasən hesablana bilməz.Yalnız flüoresan siqnalın eksponensial gücləndirmə mərhələsində PCR məhsulunun miqdarının loqarifmi ilə başlanğıc şablon miqdarı arasında xətti əlaqə mövcuddur və biz bu mərhələdə bunu kəmiyyətcə qiymətləndirməyi seçə bilərik.Kəmiyyətin təyini və müqayisəsinin rahatlığı üçün real vaxt rejimində flüoresan kəmiyyət PCR texnikasına iki çox vacib konsepsiya daxil edilmişdir: flüoresan həddi və CT dəyəri.
Eşik flüoresans gücləndirmə əyrisində süni şəkildə təyin edilmiş dəyərdir.PCR gücləndirilməsinin eksponensial mərhələsi.
Ct dəyəri: hər bir reaksiya borusunda flüoresan siqnalının müəyyən edilmiş domen dəyərinə çatmaq üçün keçdiyi dövrlərin sayıdır.
Ct dəyəri ilə başlanğıc şablon arasındakı əlaqə: tədqiqatlar göstərdi ki, hər bir şablonun Ct dəyəri həmin şablonun başlanğıc nüsxə nömrəsinin loqarifmi ilə xətti əlaqəyə malikdir, başlanğıc nüsxə nömrəsinin nüsxəsi nə qədər çox olarsa, Ct də bir o qədər kiçikdir. dəyər.Ct dəyərləri nisbətən sabitdir.Aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi üfüqi koordinat başlanğıc nüsxə nömrəsinin loqarifmini, şaquli koordinat isə Ct dəyərini təmsil etdiyi məlum başlanğıc nüsxə nömrəsi olan standartdan istifadə edərək standart əyri hazırlana bilər.
Buna görə də, naməlum nümunənin Ct qiymətini almaqla həmin nümunənin başlanğıc nüsxə nömrəsini standart əyridən hesablamaq olar.
Ct dəyəri sabit deyil və müxtəlif nümunələr və müxtəlif alətlər tərəfindən təsirlənə bilər, hətta eyni nümunə eyni alətdə 2 dəfə təkrarlansa belə, Ct dəyəri dəyişə bilər.
Kəmiyyət flüoresan analizləri: Kəmiyyət flüoresan analizləri istifadə olunan markerlərdən asılı olaraq flüoresan zondlara və flüoresan boyalara bölünə bilər.Floresan zondlarına Beacon texnologiyası (Amerika Tagyi tərəfindən təmsil olunan molekulyar mayak texnologiyası), TaqMan zondları (ABI tərəfindən təmsil olunur) və FRET texnologiyası (Roche tərəfindən təmsil olunur);flüoresan boyalara doymuş flüoresan boyalar və doymamış flüoresan boyalar daxildir, doymamış flüoresan boyaların tipik nümayəndəsi hazırda tez-tez istifadə olunan SYBRGreen I-dir;doymuş Doymamış flüoresan boyaların tipik nümayəndəsi SYBRGreenⅠ;doymuş flüoresan boyalar EvaGreen, LCGreen və s.
SYBRGreenI, qeyri-spesifik olaraq cüt zəncirli DNT ilə bağlanan flüoresan PCR üçün çox istifadə edilən DNT bağlayıcı boyadır.Sərbəst vəziyyətdə SYBRGreenI zəif flüoresans yayır, lakin bir dəfə cüt zəncirli DNT-yə bağlandıqda onun flüoresansı 1000 dəfə artır.Buna görə də, bir reaksiya tərəfindən buraxılan ümumi flüoresan siqnal mövcud ikiqat zəncirli DNT miqdarına mütənasibdir və gücləndirmə məhsulu artdıqca artır.
Cüt zəncirli DNT-ni birləşdirən boyaların üstünlükləri: sadə eksperimental dizayn, yalnız 2 primer tələb olunur, zondların dizaynına ehtiyac yoxdur, çoxlu genin sürətli sınağı üçün çoxlu zondların dizaynına ehtiyac yoxdur, ərimə nöqtəsi əyrisi analizini yerinə yetirmək bacarığı, spesifikliyini yoxlamaq. gücləndirmə reaksiyası, aşağı ilkin qiymət, yaxşı ümumilik və buna görə də ölkədə və xaricdə tədqiqatlarda daha çox istifadə olunur.
Floresan zond üsulu (Taqman texnikası): PCR gücləndirilməsi həyata keçirildikdə, xüsusi bir flüoresan zondla birlikdə bir cüt primer əlavə edilir.Zond bütöv olduqda, reportyor qrupu tərəfindən buraxılan flüoresan siqnal söndürülmüş qrup tərəfindən udulur və PCR aləti tərəfindən aşkar edilmir;PCR gücləndirilməsi zamanı (uzatma mərhələsində) Taq fermentinin 5'-3' parçalanma aktivliyi probu enzimatik olaraq deqradasiya edərək məruzəçi flüoresan qrupunu və söndürülmüş flüoresan qrupu yaradır.
Floresan kəmiyyət PCR tətbiqləri.
Molekulyar biologiya tədqiqatı:
1. Nuklein turşusunun kəmiyyət analizi.Yoluxucu xəstəliklərin kəmiyyət və keyfiyyət təhlili, patogen mikroorqanizmlərin və ya virusların, məsələn, son A (H1N1) qripi epidemiyası, transgen bitki və heyvanların gen surətlərinin sayının aşkarlanması, RNT geninin inaktivasiya dərəcələrinin aşkarlanması və s.
2. Diferensial gen ifadə analizi.Müalicə olunan nümunələr arasında gen ifadəsi fərqlərinin müqayisəsi (məsələn, dərman müalicəsi, fiziki müalicə, kimyəvi müalicə və s.), müxtəlif fazalarda spesifik genlərin ifadə fərqləri və cDNA mikroarray və ya diferensial ifadə nəticələrinin təsdiqi
3. SNP aşkarlanması.Tək nukleotid polimorfizmlərinin aşkarlanması fərdi müxtəlif xəstəliklərə qarşı həssaslığın və ya spesifik dərmanlara fərdi reaksiyanın öyrənilməsi üçün vacibdir və molekulyar mayakların zəka strukturuna görə, bir SNP-nin ardıcıllıq məlumatı məlum olduqdan sonra, onu tapmaq asan və dəqiqdir. yüksək məhsuldarlıqlı SNP aşkarlanması üçün bu texnikadan istifadə edin.
4. Metilləşmənin aşkarlanması.Metilasiya bir çox insan xəstəlikləri, xüsusilə də xərçənglə əlaqələndirilir və Laird, metilləşdirilmiş və metillənməmiş DNT-ni ayırd etmək üçün xüsusi primerlərdən və Taqman zondlarından istifadə edərək, gücləndirilmədən əvvəl DNT-ni müalicə edən, metillənməmiş sitozinin urasil və metilləşdirilmiş sitozinə təsir göstərməyən Metilayt adlı texnikanı bildirdi. .daha həssas.
Tibbi tədqiqat:
1. Prenatal diaqnostika: insanlar genetik materialın dəyişdirilməsi nəticəsində yaranan irsi xəstəlikləri müalicə edə bilmirlər və indiyə qədər müxtəlif irsi xəstəliklərin baş verməsinin qarşısını almaq üçün yalnız prenatal monitorinq yolu ilə doğulan xəstə körpələrin sayını azalda bilərlər.Bu, hamilə qadınlar tərəfindən asanlıqla qəbul edilən qeyri-invaziv bir üsuldur.
2. Patojenin aşkarlanması: Floresan kəmiyyət PCR analizi gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, insan papilloma virusu, herpes simplex virusu, insan immunçatışmazlığı virusu, hepatit virusu, qrip virusu, MycobactcyV və EBerculosis.Ənənəvi sınaq üsulları ilə müqayisədə yüksək həssaslıq, aşağı nümunə ölçüsü, sürətlilik və sadəlik üstünlüklərinə malikdir.
3. Dərmanların effektivliyinin qiymətləndirilməsi: hepatit B virusunun (HBV) və hepatit C virusunun (HCV) kəmiyyət təhlili göstərir ki, virus yükü ilə müəyyən dərmanların effektivliyi arasında əlaqə var.Əgər lamivudinlə müalicə zamanı serum HBV-DNT səviyyəsi azalırsa və sonra yenidən yüksəlirsə və ya əvvəlki səviyyəni keçərsə, bu, virus mutasiyasının göstəricisidir.
4. Onkogenetik test: Şişin inkişaf mexanizmi hələ aydın olmasa da, onkogen transformasiyanın əsas səbəbinin müvafiq genlərdəki mutasiyaların olduğu geniş şəkildə qəbul edilir.Onkogenlərin artan ifadəsi və mutasiyası bir çox şişin erkən mərhələlərində müşahidə edilə bilər.Real vaxt rejimində flüoresan kəmiyyət PCR yalnız genlərdə mutasiyaların aşkarlanmasında effektiv deyil, həm də onkogenlərin ifadəsini dəqiq aşkar edə bilir.Bu üsul telomeraz hTERT geni, xroniki qranulositik lösemi WT1 geni, onkogen ER geni, prostat xərçəngi PSM geni və şişlə əlaqəli viral genlər də daxil olmaqla müxtəlif genlərin ifadəsini aşkar etmək üçün istifadə edilmişdir.
www.DeepL.com/Translator ilə tərcümə olunub (pulsuz versiya)
Göndərmə vaxtı: 21 iyun 2022-ci il